实测Simgen液体Carrier RNA的稳定性

作者:新景实验室
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在痕量级(pgng级别)核酸的分离、纯化过程中,不论是经典的酚氯仿抽提+醇沉淀,或者是现在市场主流的硅胶膜法或磁珠法,回收率都会严重降低,最多的能损失90%的核酸。如果在痕量核酸提取体系中额外添加Carrier RNA,其结果就是将痕量级的核酸分离纯化体系重新还原到μg级别核酸的分离纯化体系。如果用荧光定量PCR检测回收的痕量核酸,其结果就是添加Carrier RNA的检测结果会明显减小3~4CT值。病毒核酸回收体系是业界公认的痕量级核酸回收体系,一家核酸诊断试剂公司提供的病毒核酸提取体系是否有添加Carrier RNA,几乎可以直接推断出该企业提供的病毒核酸检测产品的灵敏度。因此2020新冠病毒疫情导致SimgenCarrier RNA一跃成为了公司的明星产品。由于很多用户向我们询问“Carrier RNA室温能放多久寄到的时候冰袋不冷了,Carrier RNA还能用吗等诸多问题,所以我们特地耗时2个月专门对Carrier RNA进行了真实稳定性测试。

一、实验目的:

测试Carrier RNA的稳定性:37℃环境下存放的液体Carrier RNA对使用性能的影响。

二、实验材料与设备:

Carrier RNASimgen Cat.No.4003101

RNA保护剂(Simgen Cat.No.4006030

DL 2000 Marker (Simgen Cat.No.MD1006 )

电热恒温培养箱(上虞市沪越仪器设备厂,DHG 303-0

电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型 )

病毒核酸提取试剂盒(Simgen Cat.No.4002050

台式离心机(eppendorf Centrifuge 5415 D

2×One Step Probe RT-PCR MixSimgen Cat.No.7406100

荧光定量PCR仪(ABI 7500

新冠病毒引物及探针(F:CCCTGTGGGTTTTACACTTAA/R:ACGATTGTGCATCAGCTGA,

Probe:5′FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1′3

新冠假病毒(用血清稀释到106 copies/ml)

三、实验内容:

1. 取两支同一批次的Carrier RNA1 ml),一支放置于﹣20℃冰箱保存,一支放置于37℃恒温箱保存。

2. 每天取出两支Carrier RNA,各吸取10 μlRNA保护剂稀释60倍,混匀。

3. 各取5 μl加入1%的琼脂糖凝胶中,加入5 μl DL 2000 Marker,电泳20 min,观察条带情况。

4. 实验进行一段时间后,分别添加了这两支Carrier RNASimgen病毒核酸提取试剂盒提取血清中的新冠假病毒,并使用2×One Step Probe RT-PCR Mix进行扩增测试。

四、实验结果:

1. 电泳结果:(由于图片较多,且很多图片中的Carrier RNA条带情况相差不大,因此选择了其中变化较明显的图片)


正式实验前先进行了一次电泳测试,因为是同一批次的,此时的两支
Carrier RNA电泳条带几乎一样,没有差别。


实验第3天,两支Carrier RNA的条带没有明显差别


实验第5天,两支Carrier RNA的条带仍看不到明显差别,37℃保存的Carrier RNA未出现明显降解

 

实验第7天,可以看到两支Carrier RNA的条带开始出现差别37℃保存的Carrier RNA条带出现不太明显的降解情况


实验第
12天,可以看到37℃保存的Carrier RNA降解情况已经较为明显,拖尾情况比前几天要严重一些。

实验第19天,可以看到37℃保存的Carrier RNA降解情况较为严重了,较长的条带已经暗淡了很多。


实验第
27天,可以看到37℃保存的Carrier RNA较长的条带只能隐约看到了,
降解非常严重实验第
19天,可以看到37℃保存的Carrier RNA降解情况较为严重了,较长的条带已经暗淡了很多。

 

 实验第33天,可以看到37℃保存的Carrier RNA较长的条带几乎看不见了,但是两条带之间的区域还是有拖尾。

实验第46天,可以看到37℃保存的Carrier RNA两条带之间的拖尾也已经降解得快看不到了


实验第
59天(最后一次实验,因为测试用的Carrier RNA使用完了),可以看到此时37℃保存的Carrier RNA状态和之前第46天时差不多,这十多天变化并不是很明显,
降解的Carrier RNA片段主要集中在500 nt~1000 nt的位置。实验第
46天,可以看到37℃保存的Carrier RNA两条带之间的拖尾也已经
降解得快看不到了

2. 荧光定量PCR结果:(实验第46天(图9)时进行的测试)


34是使用﹣20℃保存的Carrier RNA提取的
新冠假病毒RNART-qPCR结果;12是使用37℃保存的Carrier RNA提取的
新冠假病毒RNART-qPCR结果;

56是未使用Carrier RNA提取的新冠假病毒RNART-qPCR结果。 

五、实验讨论与分析:

1. 结合图1~10分析可知,由于Carrier RNA是溶解在RNA保护剂中的,所以液体Carrier RNA37℃条件存放了接近2周时间才开始观察到较明显的降解现象。如果Carrier RNA放在室温环境下(15-25℃,估计要2周以上才能观察到较为明显的降解现象。当然也说明了液体Carrier RNA如果要长时间稳定保存,还是需要放在﹣20℃

2. 结合图2~5可知,液体Carrier RNA37℃下短期内放置影响不大,至少7天之内Carrier RNA的电泳带型未发生明显的变化。因此即便户收到Carrier RNA时发现冰袋已经融化,只要时间不超过7天(除非环境温度高达40~50℃),也并不需要担心产品的使用性能会受到影响

3. 结合图11可以发现37℃保存有降解Carrier RNA提取的假病毒RNART-qPCRCT值居然比﹣20℃保存的还要小一些。出现这样的实验结果实在令人费解,但是我们实验室经过多次重复实验,结果仍然是有降解的Carrier RNA用于假病毒RNA提取后RT-qPCRCT值小于20℃保存Carrier RNA。所以我们得出的结论是37℃放置了一个多月(46天),电泳观测有降解的Carrier RNA对使用性能仍然没有影响。

4. 结合图910的对比可以观察到37℃下保存46天和59天的Carrier RNA电泳带型差别不大,因此我们估计即便是37℃下保存2个月的Carrier RNA,对使用性能也还是没有影响

由于在病毒RNA纯化体系中,如果加入过多的Carrier RNA,对逆转录酶会产生干扰这一点我们是已知的因此我们猜测,在相同浓度的前提下,可能是降解的Carrier RNA(本质上是片段500 nt~1000 nt范围内的Carrier RNA)比完整的Carrier RNA对逆转录酶的干扰更少,所以在RT-qPCR的结果上显示出来的就是CT值稍微小一些。当然真正的原因,仍然是未知,我们欢迎阅读的同学、老师们提出你们的猜想。