如何提取大豆种子RNA

作者：新景实验室
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前段时间有客户询问说是用Trizol提取大豆种子RNA失败了，要如何才能提取大豆种子RNA？Trizol作为一种经典RNA提取方法，确实应用广泛，但在提取植物样本的RNA时就很容易出现问题。大豆种子中含有较多的蛋白质、脂肪和碳水化合物等丰富的营养物质，最大的可能是大豆种子中的多糖类物质（碳水化合物）和Trizol中的硫氰酸根凝结成了不溶物，导致RNA释放不出来，从而影响了RNA的提取。

还好小新手头上有两种不含硫氰酸根组分的植物RNA试剂盒，一种是植物总RNA试剂盒（Simgen Cat.No.5101050），这款试剂盒与国内知名品牌T***GEN的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的操作步骤、提取效果都是一致的；另一种是高多糖多酚植物总RNA试剂盒（Simgen Cat.No.5103050），这款产品是专门为高多糖多酚样本而生的，能解决植物总RNA试剂盒束手无策的样本（有兴趣的同学可以了解下这篇文章——《高多糖多酚植物总RNA试剂盒哪家强？》）。接下来就让小新用两种试剂盒对比提取一下大豆种子的RNA，看看能否成功，效果又是如何。

 

实验目的：

对比Simgen的两种植物总RNA试剂盒在提取大豆种子RNA时的性能差异。

 

实验材料：

新鲜大豆种子、一次性手术刀、研钵

高多糖多酚植物总RNA试剂盒（Simgen Cat.No.5103050）、植物总RNA试剂盒（Simgen Cat.No.5101050）

超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）

台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）

电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）

 

实验方法：

由于大豆非常容易研碎，本次实验采用裂解液浸泡样本研磨法破碎样本后提取RNA，具体操作步骤如下：

Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒

Simgen植物总RNA试剂盒

1. 称取300 mg组织放入研钵中。加入1.8 ml已加入β-巯基乙醇的Buffer RCT，充分研磨直至组织呈匀浆状，分别吸取700 μl匀浆液（按100 mg组织换算成100 μl匀浆物+600 μl裂解液计算）到2个RNase-free的1.5 ml离心管中；

2. 加600 μl Buffer EX，用力混合均匀后12000 rpm离心5 分钟；

3. 吸取350 μl上清于洁净的1.5 ml管中，加入350 μl Buffer K混合均匀，混合液全部转移到过滤柱中，13000 rpm离心1分钟；

4. 弃过滤柱，向滤液中加入700 μl 70％乙醇混合均匀，将混合液分两次加入核酸纯化柱中，离心弃滤液；

5. 依次加入500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR洗涤；

6. 14000 rpm空离1 min去除残留乙醇；

7. 将核酸纯化柱置于洁净的RNase-free的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入100 μl RNase-Free Water，室温静置1 min，离心洗脱得到RNA。

1. 称取300 mg组织放入研钵中，加入1.8 ml已加入β-巯基乙醇的Buffer RLC，充分研磨直至组织呈匀浆状，分别吸取700 μl匀浆液（按100 mg组织换算成100 μl匀浆物+600 μl裂解液计算）到2个RNase-free的1.5 ml离心管中，13000 rpm离心2分钟；

2. 将步骤1中的上清液全部倒入过滤柱中，盖上管盖，13000 rpm离心2分钟。

3. 弃过滤柱，此时滤液上层漂浮着一层白色油脂，小心吸取下层液体转移到一个洁净的1.5 ml管中，加入600 μl 70％乙醇混合均匀，将混合液分两次加入核酸纯化柱中，离心弃滤液；

4. 依次加入500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR洗涤；

5. 14000 rpm空离1 min去除残留乙醇；

6. 将核酸纯化柱置于洁净的RNase-free的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入100 μl RNase-Free Water，室温静置1分钟，离心洗脱得到RNA。

 

实验结果：

1、在超微量分光光度计上用试剂盒内的RNase-Free Water调零，测量洗脱下来的RNA，结果如下：

 simgen-植物总RNA试剂盒-高多糖多酚植物总RNA试剂盒-洗脱下来的DNA测量结果

2、在1%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl洗脱的RNA进行电泳，结果如下：

simgen-植物总RNA试剂盒-高多糖多酚植物总RNA试剂盒-电泳结果图

分析与讨论：

1. 由浓度测量结果可以看出Simgen的两种植物RNA试剂盒均能提出大豆种子中的RNA，植物总RNA试剂盒提取的RNA平均浓度约为275.3 ng/μl，而高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取的RNA平均浓度约为489.3 ng/μl，浓度更高；从电泳结果也能看出高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取的RNA条带更亮，与浓度数值有很好的对应关系。因此高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取大豆种子RNA的效果更好。

2. 使用植物总RNA试剂盒时，大豆种子加裂解液研磨离心（步骤1）后，会发现有一层白色油脂漂浮于上清液表面，且经过滤柱过滤（步骤2）后仍有残留（见下图）。为避免油脂对后续RNA的洗涤和洗脱造成影响，因此增加了步骤3中“此时滤液上层漂浮着一层白色油脂，小心吸取下层液体转移到一个洁净的1.5 ml管中”的操作，使得操作变得更麻烦了。

simgen-植物总RNA试剂盒-高多糖多酚植物总RNA试剂盒-残留的白色油脂示意图
 综上，虽然两种试剂盒均能提取大豆种子的RNA，但是高多糖多酚植物总RNA试剂盒效果更好，不仅提取的浓度更高，而且排除了大豆种子中油脂的干扰，操作显得更为方便。

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