Carrier RNA的存在对血浆游离核酸纯化效率的影响

Carrier RNA的存在对血浆游离核酸纯化效率的影响

实验目的：在实验中设计Carrier RNA的添加与否以探究其对小片段核酸纯化的回收效率的影响。

实验材料及设备：

血浆游离核酸纯化试剂盒（simgen）、Carrier RNA(simgen)、人血浆（购自浙江省血液中心）、无水乙醇、动物源性检测试剂盒（猪源）（simgen）

样本：猪源的扩增产物（引物Forward CGACAAAGCAACCCTCACAC；引物Reverse TGCGAGGGCGGTAATGAT长度为70 bp）用Buffer TE稀释10000倍后，再用人血浆稀释1000倍作为含有游离核酸的血浆样本。

设备：ABI 7000 荧光PCR仪、漩涡震荡仪、水浴锅、离心机及移液器

其他耗材：1.5ml离心管、八连排PCR管，RNase-free吸头，一次性手套及防护用品和纸巾。

实验方法：

1、  根据simgen血浆游离核酸纯化试剂盒的说明书的操作步骤，按照下列方案进行操作，提取DNA。

注：编号1─4为体液为200 μl时，且在Carrier RNA加与不加时对扩增的影响，同时将体液样品扩大4倍即编号5─8，探究Carrier RNA加与不加的影响。

2、  用simgen的动物源性检测试剂盒（猪源）配制PCR混合液，将取得的8管DNA按照5 μl/管加入到PCR反应体系混合液中，进行荧光PCR扩增，观察实验结果。

实验结果：

杭州新景生物实验图2、800ul体液样本的扩增曲线

讨论与分析：

1. 从图1分析：加入Carrier RNA的1号和2号CT值比3号小约1.5个CT值；比4号小约3.5个CT值。说明该核酸纯化体系中，如果不含Carrier RNA，痕量核酸的回收效率会变得不稳定，是加入Carrier RNA的核酸纯化体系回收效率的1/10—1/3。

2. 从图2分析：加入Carrier RNA的5号和6号CT值比7号和8号小约3.3个CT值。说明该核酸纯化体系中，如果不含Carrier RNA，则会是加入Carrier RNA的核酸纯化体系回收效率的1/10左右。

3. 小片段（本实验是70bp）痕量DNA（pg级别）用柱纯化回收的过程中，CarrierRNA的加入，能显著提高回收效率。

杭州新景生物实验室

2015年11月10 日