新景实验室在去年时接到一些质粒提取的技术服务,其中有相当一部分是低拷贝质粒的细菌,这些细菌过夜培养后(OD600=3.2)的每毫升菌液一般只能提到2微克左右的质粒。就是说如果我们需要提取2mg的质粒,我们就需要培养1L以上的菌液来提取,但这只是在100%提取效率的理论状态下所需的量,而实际操作中是不可能达到100%地提取到所有的质粒,一般最多能得到80%-90%的提取率,我们先看一下下表数据:
编号 | 260 | 230 | 280 | 260/230 | 260/280 | 浓度(ng/μl) |
1 | 1.975 | 1.142 | 1.079 | 1.73 | 1.83 | 98.75 |
2 | 1.983 | 1.153 | 1.072 | 1.72 | 1.85 | 99.15 |
3 | 1.685 | 0.952 | 0.830 | 1.77 | 2.03 | 84.25 |
4 | 1.696 | 0.964 | 0.844 | 1.76 | 2.01 | 84.81 |
5 | 23.156 | 13.009 | 11.814 | 1.78 | 1.96 | 1157.83 |
6 | 23.136 | 13.221 | 11.804 | 1.75 | 1.96 | 1156.88 |
1、2为3ml细菌进行质粒小提,60μl洗脱得到的质粒DNA;3、4为100ml细菌进行质粒中抽,2ml洗脱得到的质粒DNA;5、6是2ml质粒中抽的DNA溶液进行DNA浓缩,100μl洗脱得到的质粒DNA。
从上表可以看到我们用100ml菌液进行一次质粒中抽,只能得到115μg左右的高浓度质粒DNA,就是说我们要提2mg的质粒就需要培养2L左右的菌液,要进行20次左右的质粒中抽。这样不仅耗时长,而且成本高,效率低,那么怎样才能提高低拷贝质粒的提取效率呢?
小编通过查找文献发现一种可以提高低拷贝质粒拷贝数的方法,就是在细菌处于对数生长中期的时候加入氯霉素,因为氯霉素会抑制蛋白质合成,从而抑制细菌的繁殖,但是却不会抑制细菌的质粒合成,故此时细菌中的质粒仍可以复制合成。
为了验证,小编做了一些实验,首先挑取单菌落至5ml菌液中(2支),加入对应抗生素,37℃220rpm 培养2-3h,将两支菌液各全部转入300ml含相应抗生素的菌液中37℃220rpm 培养6-8h,此时细菌进入对数生长中期,然后向其中一瓶加入氯霉素至终浓度为170μg/ml,两瓶菌液37℃220rpm 继续培养12-16h左右。
然后取3ml菌液各两支以及相同干重量细菌各两支,编上编号,进行质粒DNA小提,60μl洗脱得到的质粒DNA并测OD,结果如下表:
编号 | 260 | 230 | 280 | 260/230 | 260/280 | 浓度(ng/μl) |
1 | 1.975 | 1.142 | 1.073 | 1.73 | 1.84 | 98.75 |
2 | 1.983 | 1.133 | 1.084 | 1.75 | 1.83 | 99.15 |
3 | 2.509 | 1.418 | 1.379 | 1.77 | 1.82 | 125.47 |
4 | 2.436 | 1.361 | 1.338 | 1.79 | 1.82 | 121.78 |
5 | 3.292 | 1.925 | 1.706 | 1.71 | 1.93 | 164.58 |
6 | 3.302 | 1.898 | 1.702 | 1.74 | 1.94 | 165.18 |
7 | 11.186 | 6.356 | 6.014 | 1.76 | 1.86 | 559.32 |
8 | 11.143 | 6.260 | 5.991 | 1.78 | 1.86 | 557.13 |
1、2为3ml正常培养的菌液,3、4为3ml含氯霉素的菌液,5、6为5mg干重正常培养的菌体,7、8为5mg干重含氯霉素的菌体。
从上表中我们可以看出,在相同菌液量的时候,质粒DNA总量并无多大提高,而在相同菌体干重下却有很大的提高,这是因为氯霉素抑制细菌生长繁殖导致每毫升菌液中细菌少,又因为氯霉素不会抑制质粒DNA的复制合成,所以相同细菌个数下质粒DNA量提高了。
在这个实验中我们必须注意几点:
1. 细菌必须是含松弛型低拷贝质粒DNA,如果是严紧型细菌,就不能用这种方法,因为这种质粒DNA的复制是随着细菌染色体复制而复制合成的;
2. 细菌必须在细菌的对数生长中期加入氯霉素,因为过早加入时,细菌量太少,无法太多的细菌用以提取质粒DNA,而超过这个时期,细菌量过多,菌量达到饱和,部分菌体停止复制合成质粒DNA,此时加入氯霉素,效果已经不明显了;
3. 在细菌培养的操作过程中要保证无菌操作,避免杂菌污染;
好了,今天的新景实验室:分子生物百科就到这里了,希望今天的内容能对大家今后提取低拷贝质粒有所帮助,我们下期再见!!
2016年3月11日
新景生物实验室