怎样增加低拷贝质粒的提取效率

作者:新景实验室
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新景实验室在去年时接到一些质粒提取的技术服务,其中有相当一部分是低拷贝质粒的细菌,这些细菌过夜培养后OD600=3.2的每毫升菌液一般只能提到2微克左右的质粒。就是说如果我们需要提取2mg的质粒,我们就需要培养1L以上的菌液来提取,但这只是在100%提取效率的理论状态下所需的量,而实际操作中是不可能达到100%地提取到所有的质粒,一般最多能得到80%-90%的提取率,我们先看一下下表数据:

 

编号

260

230

280

260/230

260/280

浓度(ng/μl

1

1.975

1.142

1.079

1.73

1.83

98.75

2

1.983

1.153

1.072

1.72

1.85

99.15

3

1.685

0.952

0.830

1.77

2.03

84.25

4

1.696

0.964

0.844

1.76

2.01

84.81

5

23.156

13.009

11.814

1.78

1.96

1157.83

6

23.136

13.221

11.804

1.75

1.96

1156.88

123ml细菌进行质粒小提,60μl洗脱得到的质粒DNA34100ml细菌进行质粒中抽,2ml洗脱得到的质粒DNA562ml质粒中抽的DNA溶液进行DNA浓缩,100μl洗脱得到的质粒DNA

 

从上表可以看到我们用100ml菌液进行一次质粒中抽,只能得到115μg左右的高浓度质粒DNA,就是说我们要提2mg的质粒就需要培养2L左右的菌液,要进行20次左右的质粒中抽。这样不仅耗时长,而且成本高,效率低,那么怎样才能提高低拷贝质粒的提取效率呢?

小编通过查找文献发现一种可以提高低拷贝质粒拷贝数的方法,就是在细菌处于对数生长中期的时候加入氯霉素,因为氯霉素会抑制蛋白质合成,从而抑制细菌的繁殖,但是却不会抑制细菌的质粒合成,故此时细菌中的质粒仍可以复制合成。

为了验证,小编做了一些实验,首先挑取单菌落至5ml菌液中(2支),加入对应抗生素,37℃220rpm 培养2-3h,将两支菌液各全部转入300ml含相应抗生素的菌液中37℃220rpm 培养6-8h,此时细菌进入对数生长中期,然后向其中一瓶加入氯霉素至终浓度为170μg/ml,两瓶菌液37℃220rpm 继续培养12-16h左右。

然后取3ml菌液各两支以及相同干重量细菌各两支,编上编号,进行质粒DNA小提,60μl洗脱得到的质粒DNA并测OD,结果如下表:

编号

260

230

280

260/230

260/280

浓度(ng/μl

1

1.975

1.142

1.073

1.73

1.84

98.75

2

1.983

1.133

1.084

1.75

1.83

99.15

3

2.509

1.418

1.379

1.77

1.82

125.47

4

2.436

1.361

1.338

1.79

1.82

121.78

5

3.292

1.925

1.706

1.71

1.93

164.58

6

3.302

1.898

1.702

1.74

1.94

165.18

7

11.186

6.356

6.014

1.76

1.86

559.32

8

11.143

6.260

5.991

1.78

1.86

557.13

123ml正常培养的菌液,343ml含氯霉素的菌液,565mg干重正常培养的菌体,785mg干重含氯霉素的菌体。

 

从上表中我们可以看出,在相同菌液量的时候,质粒DNA总量并无多大提高,而在相同菌体干重下却有很大的提高,这是因为氯霉素抑制细菌生长繁殖导致每毫升菌液中细菌少,又因为氯霉素不会抑制质粒DNA的复制合成,所以相同细菌个数下质粒DNA量提高了。

在这个实验中我们必须注意几点:

1. 细菌必须是含松弛型低拷贝质粒DNA,如果是严紧型细菌,就不能用这种方法,因为这种质粒DNA的复制是随着细菌染色体复制而复制合成的;

2. 细菌必须在细菌的对数生长中期加入氯霉素,因为过早加入时,细菌量太少,无法太多的细菌用以提取质粒DNA,而超过这个时期,细菌量过多,菌量达到饱和,部分菌体停止复制合成质粒DNA,此时加入氯霉素,效果已经不明显了;

3. 在细菌培养的操作过程中要保证无菌操作,避免杂菌污染;

好了,今天的新景实验室:分子生物百科就到这里了,希望今天的内容能对大家今后提取低拷贝质粒有所帮助,我们下期再见!!

 

 

 

                                               2016311

                                                 新景生物实验室