用分子实验方法鉴定真菌菌种

作者：新景实验室
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如果大家拿到一株未知真菌，想检测真菌种属，该怎么做呢？今天小编就在这里为大家讲一下未知真菌的DNA提取、凝胶回收、测序分析及进化树的绘制。

 

一、准备实验试剂及仪器：

1．DNA提取：植物DNA试剂盒（simgen，Cat.No.3201-050），液氮；

2．PCR 试剂：2 × Taq PlusPCR Master Mix（Simgen，Cat.No.7005100），

引物（ITS 1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG

      ITS 4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）；

3．DNA Marker：DL2000 Ladder（simgen，Cat.No.MD1006）；

4．PCR产物纯化：凝胶DNA回收试剂盒（simgen，Cat.No.2001-050）；

5．实验仪器：水浴锅，离心机，研钵，电泳仪，PCR仪，移液器，Sim-100超微量紫外分光光度计（simgen，Sim-100）。

注：1. 植物DNA试剂盒（simgen，Cat.No.3201-050）可用于真菌DNA提取；

    2. 引物由Invitrogen公司合成。

 

二、DNA的提取及浓度测定：

1． 将真菌从培养基上刮下或从菌液中收集，转至研钵中，加入液氮研磨至面粉状；

2． 研磨充分后加入500μl 65℃预热的Buffer PL，继续研磨一段时间，取500μl混合液至洁净的1.5ml离心管中（若不足500μl 混合液，加Buffer PL补至500μl ）；

3． 接下的步骤按照植物DNA试剂盒（simgen，Cat.No.3201-050）说明书操作，100μl Buffer TE洗脱DNA；

4． 测OD。

真菌DNA提取结果：

编号

OD260

OD280

OD230

260/230

260/280

浓度(ng/μl)

1

2.82

1.49

1.32

2.14

1.90

140.92

2

2.21

1.19

1.07

2.07

1.86

110.54

 

三、PCR扩增及回收纯化：

1．  按下表配置PCR体系

试剂

用量

2× Taq PCR MASTER Mix（Simgen）

20μl

Primer 1（10mM）

1μl

Primer 2（10mM）

1μl

ddH2O

13μl

Template

5μl

 

2.  PCR反应程序：

PCR 反应条件


3. 电泳检测及凝胶回收：

PCR产物电泳图：


凝胶回收：

A.  PCR产物电泳，并切胶（注：胶最好切得薄一点）；

B.  按照凝胶DNA回收试剂盒（simgen）说明书操作，30μl Buffer TE洗脱DNA,并测OD值。

凝胶回收DNA结果：

编号

OD260

OD280

OD230

260/230

260/280

浓度(ng/μl)

1

2.331

1.262

1.839

1.27

1.85

116.53

2

2.265

1.231

2.063

1.10

1.84

113.24

四、将凝胶回收产物送测序公司测序

 测序结果绘制进化树：


从以上实验结果可以分析得到此真菌与比对到的真菌有非常近的亲缘关系，应该也是属于Paecilomyces。

如有不理解的，可以联系杭州新景生物试剂开发有限公司技术部：892873021@qq.com。


新景生物实验室

2016年04月20日



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