荧光PCR常见问题之-------核酸背景的影响

最近有客户反映在做荧光PCR时遇到了一个问题，就是以cDNA为模板做荧光PCR时，荧光曲线起线非常早（CT<10），但是扩增结束后分析，荧光曲线却呈阴性曲线或向下倒，而溶解曲线却又有显示，与目的基因的溶解曲线相同，都是单峰，且峰值相近。

根据客户反馈的信息，我们对此现象进行分析：因为溶解曲线与目的基因的溶解曲线相同，表示扩增体系是有扩增的，且扩增产物应该是所需目的基因。但是起线早，分析却呈阴性状态，这是为什么呢？我们对此现象进行重复实验，发现PCR预混液和引物没有问题，问题应该在模板上--我们猜测可能是在逆转录过程中在oligo -dT和随机引物作用下形成了大量的cDNA-RNA杂交体，cDNA-RNA杂交体也是双螺旋结构，如下图：

而SYBR Green PCR Mix中含有的SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，它可能也会结合cDNA-RNA杂交体双螺旋小沟区域从而产生荧光。

为了证明以上猜测，我设计了一个实验：

*注：RNA、cDNA及DNA必须是不参加PCR扩增的，否则会影响实验结果。

其他来源的RNA、cDNA或DNA代替水补足PCR体系，进行PCR反应，观察其现象，结果如下图：

从上图可看出，以水或者以RNA代替水补足PCR体系进行反应时，PCR扩增荧光曲线是正常的，但是以cDNA或DNA代替水补足PCR体系进行反应时，PCR扩增荧光曲线就出现异常，但是溶解曲线却都是在同一峰上，说明它们都在进行正常扩增，而以cDNA或DNA代替水补足PCR体系进行反应时会影响荧光的采集及结果的分析。这是因为在PCR反应时，SYBR Green I会结合于所有双螺旋小沟区域而发出荧光，电脑系统也会将这些荧光采集并进行分析，而且此时电脑是以3-15CT值间的平均荧光值作为荧光基线，如下图：

这样由于3号和4号在一开始就出现荧光值，这样在3-15 CT值间的平均荧光值就变高了，以致后面的荧光值相对于基线荧光值就接近于0甚至更小，所以在电脑分析后就会出现类似阴性的曲线出现。但是如果此时将基线数据改变就会出现不同的情况，如下图：

如果取1-2 CT值间的平均荧光值做基线，3号、4号就有起升曲线，这也说明前面的荧光平均值过高对结果分析会造成很大的影响。

所以如果出现这种情况，我建议使用特异性引物代替oligo -dT和随机引物，或者适当减少cDNA模板或者是RNA模板的用量。

新 景 生 物 实 验 室

 2016年4月29日