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容易被误读的电泳图(核酸电泳经验之谈1)

近期连续接到电泳小白的质量投诉,究其原因是看电泳没经验--感觉很有必要就一种很容易被误读的电泳图进行深入分析:

大家第一眼看上去觉得最后一孔出现拖尾带是个什么情况?拖尾严重且DNA主带较暗,是DNA降解了吗?

错。主带(长片段)是基因组DNA,拖尾带是残留的降解RNA条带--凭什么这么说?

1. 用户提取的是新鲜分离的小鼠肝脏组织DNA,并且没有加RNA酶消化。

2. 同样条件提取的DNA(第六孔)残留的拖尾带是不连续的,集中在某一区域(可以解读为残留的降解RNA较少,如果降解DNA的典型带型参考图四)。

所以小编立刻坚决地否定了用户有关DNA有降解的投诉,并预言:

1.如果在提取DNA时加入RNase A就不会出现这种现象。

2.延长电泳时间,RNA拖尾会消失,DNA主带会变亮。

3.将电泳凝胶放置一段时间(如过夜),拖尾带会变暗甚至消失,而DNA主带会变亮(可能变模糊但不会消失)。

用户带着满满的疑惑尝试了延长电泳,结果对比如图二:

有人也许会有疑问,如果不是DNA降解的话,那么DNA主带为什么会这么暗呢?其实这并非DNA量少产生的,而是由于残留的RNA过多以致电泳过程中将大部分EB带走,使得DNA主带没有足够的EB对其进行染色。但是如果继续电泳一段时间,或者干脆电泳至RNA跑到电泳缓冲液中后,DNA也就会染上足够的EB了,这时就能看到正常亮度的DNA主带了。

     我们来看看真正有降解的DNA条带是怎样的吧:

 是不是觉得第二孔和图一的第七孔很像呢?如果小编说这是DNA降解的拖尾而不是RNA降解的拖尾,是不是有点懵了。也许你们会想这看上去和刚才那RNA降解的条带没什么不同,凭什么说是DNA降解呢?别急,既然刚刚解释过如果小片段的RNA过多会将EB带走而导致跑得慢的长片段DNA没有足够的EB染上染色,那么小片段的DNA(降解的DNA)也会有同样的效果了。如果把电泳时间延长的话就能看出不同的结果了,如下图:

是不是觉得有点不可思议,刚开始相似的两幅电泳图最后却是不同的电泳结果,那么怎么去判断呢?最简便的判断方法就是看提取的样本是否是新鲜样本。如果是新鲜的样本,那么拖尾的就是降解的RNA,因为新鲜的样本一般不会出现DNA降解,但是很容易残留RNA;如果是陈旧的样本,那么一般来说拖尾就属于降解的DNA了。

如果不能确定样本是否新鲜,那么另一种有效的判断方法就是延长电泳时间。如果是降解RNA造成的拖尾,那么延长电泳时间后就会使RNA完全降解或者使RNA跑到缓冲液中。但是降解DNA造成的拖尾则不会出现这种现象,因为DNA降解时有很多片段仍然比较大,很难跑到缓冲液中,并且DNARNA稳定,不会在电泳的时间中出现很明显的降解或消失。

 所以在分析凝胶电泳图时,充足的电泳时间也很有必要,这样不仅可以使DNA Marker的各条带分开,容易对比长度,也能确认是何种核酸残留所造成的拖尾。

杭州新景生物实验室