荧光定量PCR技术在物种鉴定应用中的优势

作者:新景实验室
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在生物制品行业中,不同物种来源的同一生物制品价格差异较大,进而催生了利用生物制品中残留的DNA鉴定物种来源的技术。但由于现有市场上物种源性的鉴定技术主要以定性检测为主,导致用户收到的鉴定结果常常是一个产品中不同的物种都呈阳性,这给广大用户(特别是同一生产设备、车间生产有不同物种来源的同一生物制品的生产厂家)带来了很大的疑惑:物种DNA鉴定的方法一点都不靠谱,不准确或不灵敏。

实际上恰恰相反,由于PCR检测太灵敏了,只要有几个可作为DNA模板的分子存在,检测结果就是阳性。本实验室近期收到山东一家生产血浆蛋白粉的厂家委托的检测:他的一批猪血浆蛋白粉被鉴定为含有鸡源DNA组份,怀疑假冒猪血蛋白粉,希望我们提供更有价值的检测方法。

我们的建议是:请厂家提供一份纯的鸡血浆蛋白粉样本和一份被怀疑是假冒猪血蛋白粉的样本,一起用荧光定量PCR的方法鉴定其中鸡源DNA的含量,如果两者鸡源DNA测出的含量相差悬殊,应视为鸡源DNA蛋白粉的污染,而不应视为以鸡源蛋白粉假冒猪源蛋白粉。

 

下面小编以为用户鉴定鸡源DNA浓度为例,比较定性鉴定与定量鉴定的差别:

实验样本:鸡肉,1号血浆蛋白粉样本(鸡源),2号血浆蛋白粉样本(被怀疑是假冒猪血浆蛋白粉的鸡血浆蛋白粉)

实验试剂:动物组织DNA试剂盒(simgencat.No.3101050全血/培养细胞DNA试剂盒(simgencat.No.3002050PBS溶液(simgencat.No.9004500

DNA提取步骤:

提取鸡肉组织的基因组DNA按动物组织DNA试剂盒说明书操作,用100μl Buffer TE 洗脱DNA

血浆蛋白粉按以下步骤操作:

1. 50mg血浆蛋白粉样本溶于200μl PBS溶液,加20μl蛋白酶K混匀。

2. 然后按全血/培养细胞DNA试剂盒说明书(从全血、唾液、培养细胞、精液及革兰氏阳性菌中分离纯化总DNA)步骤二接下去操作,用100μl Buffer TE 洗脱DNA

实验器材及差异步骤:

图一PCR电泳图  

M 1 2 3 4

MDNA Marker

1:阳性对照

21号样本

32号样本

4:阴性对照

图二 荧光PCR结果荧光曲线图

图三 荧光PCR探针法结果CT值表

从图一可以看出1号样本及2号样本均呈现为与阳性条带一致的带型,阴性条带为引物二聚体的带型;2号样本的电泳带比1号的电泳带稍暗,说明2号样本中的鸡源DNA1号样本少,但是并不能确定数量上差异多少。

我们再看图二,1号样本的荧光曲线起线比2号靠前,说明1号样本的鸡源DNA2号多,从图三CT值表看,可以知道1号样本的CT值比2号小6.45CT值,说明1号样本的鸡源DNA2号高26.43倍,即大约86倍。也就是说,如果要掺假的话,2号样本中应当是取85份猪血浆蛋白粉+1份鸡血浆蛋白粉混合而成的--这个掺假实在没有利用价值,所以更好解释应当是生产环境中的鸡血浆蛋白粉残留物污染了猪血浆蛋白粉。

 

 

 

                                                                                        杭州新景生物开发有限公司实验室

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