为什么我的凝胶DNA回收率低

作者:新景实验室
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某天风和日丽,我像往常一样去公司上班,一到办公室,销售部的小伙伴就跑来向我抱怨:“小新啊,最近公司的凝胶回收试剂盒是不是质检不过关?我已经接到好几个投诉电话了!!!”

我:“你说啥!!??怎么可能,出货前都检验了,没有问题啊!!!”

在小伙伴满脸怀疑的表情下,我还是果断的再检测了一次,对比之后拿到了数据,分分钟甩了出来。

“不是吧?!85%的回收率客户还嫌低?

“可是客户反映只有不到50%……”

为了实力证明产品的质量,我决定去客户的实验室走一趟。(这么近,不去多不好啊……)一上午时间搞定,回来之后小伙伴问我怎么样。为什么我们自己检测的数据与客户做出的结果差距如此之大?下面就由小新为大家解答:凝胶回收过程中有哪些容易被忽略的要点。

对照组采用无损失凝胶回收:(每组实验均有两个重复)

30μl+120μl凝胶作为样品,然后通过正常的凝胶回收实验操作步骤(参照杭州新景生物试剂凝胶回收试剂盒说明书)。

第一组实验组:凝胶块薄厚差异(每组实验均有两个重复)

客户制胶相对较薄,实验室制得胶比较厚。这会儿估计会有小伙伴说了,做那么厚的胶岂不是浪费吗?然而真的是浪费嘛?我们来看图片

凝胶DNA回收试剂盒-图一薄样胶为仿客户制胶 

(图1:薄胶样为仿客户制胶)

凝胶DNA回收试剂盒-图二厚样胶为实验实制胶 

(图2:厚胶样为实验室制胶)

从图上我们可以很明显的看出图1的凝胶较薄,在跑样孔附近有凸起,且整块胶薄厚不均匀,图2的胶明显厚度均匀,没有明显的凸起凹陷。

那么为什么薄的胶会出现不均匀的现象呢?这在物理学上被称之为“毛细作用”(毛细作用:是由分子表面张力引起的由表面张力和分子与另一种分子之间的亲和力引起的。以上来自百度百科)。

那么薄厚不同的胶,会对最终凝胶回收效率有什么影响呢?

我们在两块厚薄不同的胶中添加了30μl同样的DNA样本,然后通过正常的凝胶回收实验操作步骤(参照杭州新景生物试剂凝胶回收试剂盒说明书),得到了最终的一份实验数据。与此同时,我们还进行了第二组实验。

第二组实验:跑胶时间对实验结果的影响(每组实验均有两个重复)

凝胶DNA回收试剂盒-跑胶时间对实验结果的影响 

点完样,稍等片刻,我们再来观察实验结果。

小新跑胶结束啦,为了效果更明显,我们需要在侧面观察侧面观察DNA在凝胶中的状态:

 

凝胶DNA回收试剂盒-1号组厚胶电泳15分钟效果 

1号组厚胶电泳15分钟效果

凝胶DNA回收试剂盒-2号组厚胶电泳30分钟效果 

 42号组厚胶电泳30分钟效果

凝胶DNA回收试剂盒-2号组厚胶电泳30分钟效果

 5:薄胶电泳15分钟效果

凝胶DNA回收试剂盒-3号组薄胶电泳30分钟效果

 63号组薄胶电泳30分钟效果

通过对比图3和图4(或者图5和图6),均可看出,随着电泳时间的加长,DNA条带出现明显的扩散。如果凝胶比较厚,如图4,大部分DNA还保留于凝胶中,但是相对较薄的凝胶,如图6,估计得有一半的DNA都跑到电泳缓冲液中了。当然,直观感受没有依据那么我们就用数据说话,接下来继续切胶回收。

实验结果:每组实验均有两个重复(真相终于要浮出水面啦~

凝胶DNA回收试剂盒-实验结果 

1号、2号、3号实验组的平均回收效率分别为:85.8%61.8%37%(看看,这就是区别!!!)。由此我们可以总结出:在凝胶回收的过程中尽量做相对厚一点的胶(为了回收效率就别在意那么一点点胶啦~),最大可能避免毛细作用导致胶体不均匀进而影响回收效率;此外尽可能不要过长时间的电泳,不然大部分的DNA都从凝胶胶体里跑到电泳缓冲液中的话,回收率当然就低啦!回收过程中还要将凝胶块融化完全,以避免堵塞纯化柱。当然这种小的细节相信大家都知道啦。好了今天的小新课堂就到这里了,下期再会!

 

 

杭州新景生物试剂开发有限公司实验室

2016126