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最近收到客户反馈“正常挑单菌培养的DH5α质粒菌提取的质粒浓度突然变的好低，是不是试剂盒配方有改动？”。Simgen作为通过ISO质量体系认证的生产企业，试剂配方若有变动，研发部、质量部、生产部、销售部都会收到文件通知。既然没有相关的文件通知，我们就向客户索要了培养好的质粒菌（K3-1、K3-22）及使用的试剂盒，并使用公司自己培养的质粒菌（Simgen-1、Simgen-2）进行测试对照。
材料与方法：
Singen实验室质粒菌培养方法：挑取单菌落到10 ml的LB液体（100 μg/ml氨苄浓度）培养基中，37℃、180 rpm过夜培养约16小时。每管收集2 ml菌液。
客户培养好的质粒菌（K3-1、K3-22）：每管收集2 ml菌液。
试剂盒：客户实验室带回的Simgen快速质粒DNA小量试剂盒，产品批号：20240429
测试方法：按说明书操作步骤提取质粒DNA后测质粒DNA浓度，并电泳观察DNA带型。
测试结果：
质粒提取浓度如下：
1：K3-1；2：K3-22；3：Simgen-1；4：Simgen-2；M：DL2000-G DNA Ladder（Simgen. Cat. No. MD1006-G）。1%琼脂糖凝胶电泳，120 V 30 min。1和2电泳上样量均为20 μl，3和4上样量为1 μl。
讨论与分析：
1） 从分光光度计测得的数据分析： Simgen两管质粒菌提取浓度及数值均在正常范围内，客户提供的质粒菌提取的质粒DNA浓度明显偏低，与客户描述相符。
2） 电泳结果分析：Simgen-1、Simgen-2质粒DNA条带正常；K3-1、K3-22提取到质粒，只有marker最上方基因组条带对应位置有暗淡的条带，说明没有提取到质粒，样本浓度显示的应该是提取到的微量基因组DNA的浓度。
由于客户给的菌液完全没有提取到质粒，询问客户后得知这两种质粒都是氨苄抗性的，于是我们将剩余的两种菌液在氨苄抗性平板上划线，过夜培养后重新挑单菌于3 ml LB培养基（100 μg/ml氨苄浓度）中培养7小时。收集1 ml菌液中的菌体重新进行质粒提取，特别仔细观察并记录了实验现象。发现有以下现象不正常：加入Buffer Ⅱ颠倒数次，液体显示有少许粘稠但未呈现透明状，相反呈现混浊状。加入Buffer N8颠倒数次，黄色的沉淀无法皱缩，始终呈水泡状，离心沉淀无法完全沉到底部，将上层较少的上清液加入核酸纯化柱，继续后续操作，提取浓度如下：
将提取的质粒进行电泳，同样显示没有提取到质粒。
K3-1、K3-22、M：DL5000。1%琼脂糖凝胶电泳，120 V 30 min。1和2电泳上样量均为20 μl。
结论如下：
1) 该菌能在含有氨苄青霉素的的平板上正常生长并形成单菌落，但是不能被Buffer II 试剂溶解（注意：正常的大肠杆菌能被Buffer II试剂溶解，菌体溶解后呈透明状）。
2) 对比菌的生长速度，该菌1 ml菌液离心获得的菌体沉淀大小相当于5 ml 大肠杆菌菌液获得的菌体沉淀大小，推测该菌生长速度较快或是单个菌菌体的体积较大所导致。
3) 对比了菌液气味，发现该菌液的气味与同步培养的DH5α宿主菌的质粒菌液气味明显不同，该菌有类似酵母菌生长的气味。
综上所述，我们判断在平板上生长的不是含质粒的大肠杆菌，而是真菌。考虑到加入Buffer Ⅱ后溶液有稍微变粘稠状，也不排除平板中的单菌落是由真菌和不含质粒的大肠杆菌混合而成的菌落的可能性，解释为由于真菌不惧抗生素菌落长得较大，无质粒的大肠杆菌在有抗生素的平板中无法单独形成菌落，只能隐藏在真菌菌落中。
后续我们特别走访了客户的实验室，并现场与客户沟通，发现客户的质粒转化和涂平板的实验没有在超净台进行无菌操作，而是在实验室内直接操作的。因此我们大致可以推测可能是室内的真菌污染了转化质粒的平板。需要注意的是大部份的抗生素作用机理是根据真核细胞和原核细胞的结构差异来抑制或杀灭细菌的，所以很多抗生素对酵母菌等真菌无效。以氨苄青霉素为例，其作用靶点是细菌细胞壁的合成过程，真菌与细菌的细胞壁结构完全不同，因此氨苄青霉素对真菌的生长抑制无效。
所以最后我们总结一下：分子生物学中的转化实验、接种实验在实验条件具备的前提下，必须在无菌的超净台中，靠近酒精灯火焰周围进行操作。若无超净工作台，则实验必须在点燃的酒精灯火焰的5~10 cm周围处进行转化或涂布以及接种等实验。
本次的实验探索也让我们了解到一个现象：即便我们从不含质粒的菌液中提取质粒DNA，也是能测到一定的DNA浓度的，只是浓度严重偏低。这是因为在质粒DNA的提取过程中，并不是完全没有细菌的基因组DNA和RNA残留的，分光光度计显示的DNA浓度就是这些残留的细菌基因组DNA和RNA的浓度。当提高提取到的DNA的电泳上样量后，就可观察到暗淡的基因组条带（RNA由于片段太小，一般情况下观察不到）。正因如此，同学们在提取质粒DNA的时候，如果发现质粒DNA浓度严重偏低，不要简单地判断细菌长得不好，或者试剂盒的质量问题，一定要将提取的质粒DNA进行电泳验证，否则就可能离真相越来越远。
