还记得前段时间偷吃实验室培养基的真菌吗？之前小新用植物/真菌DNA试剂盒（Simgen Cat.No.3200050）提取了该真菌的基因组DNA。这次小新用提取的DNA进行了PCR扩增，然后将PCR产物送去基因测序，最后在NCBI上与已知菌种序列进行比对后得出该菌种为曲霉属（Aspergillus sp.）。下面就跟小新一起回顾一下具体的操作步骤吧。
实验目的：
鉴定未知真菌菌种。
实验材料：
1. 样本：提取好的真菌DNA。
2. 2×PCR Mix（Simgen Cat.No.7003100）、真菌ITS引物（ITS1：5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’/ITS4：5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）和（ITS5：5?-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3?/ITS4：5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）
3. PCR仪：Techne FPROGO5Y Progene Thermal
4. 电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型 ）
5. 相关网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
实验内容：
1. PCR扩增：
① 将2×PCR Mix、ddH2O、模板DNA和引物室温解冻，置于冰上。
② 将解冻后各个组分上下翻转混合均匀，按下列组成配制PCR反应液：
③ 手指轻弹PCR反应管充分混匀，简短离心。
④ 按下方条件设置PCR程序：
94℃，4 min→（94℃，45 s→55℃，45 s→72℃，1 min）×35 cycles→72℃，5 min
2. 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
3. 将获得的PCR扩增产物及引物交由测序公司测序。
4. 在NCBI网站上对比序列，确定真菌菌种。
打开NCBI，选择BLAST，选择Nucleotide Blast，在Enter Query Sequence序列框内输入核苷酸序列，输入Job Title，在默认条件下BLAST，得到结果。
5. MEGA5碱基序列比对。
打开MEGA5，将菌种的碱基序列输入，点击W进行比对，删除两端不能比对的碱基序列，将比对结果保存。关闭页面，在主页面打开Analysis→Phylogeny→Construct/Test Neighbor-Joining Tree...参数选择Bootstrap method输入1000，开始建树。
实验结果
1. 凝胶电泳结果：
在1%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl扩增产物、DL2000 DNA Ladder，电泳15分钟，结果如下：
2. 序列比对结果：
NCBI Nucleotide BLAST结果截图（部分）如下：
通过MEGA5软件对未知菌种及其相似菌株核苷酸序列进行比
对，删除两侧多余的不能比对的序列，对未知菌种及其相似菌株核苷酸序列分别建立系统发育树，结果如下：
讨论与分析
1. 本次真菌鉴定是通过扩增并测序未知菌种的ITS序列，然后与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌的种属信息。为了提高准确率，使用了两对引物分别进行扩增、测序和对比。
2. 从电泳图能看到，两对引物均扩增出了条带，且位置差不多，序列对比结果也几乎一致。根据NCBI BLAST的结果来看，未知菌种应属于曲霉属（Aspergillus sp.）。其菌种核苷酸序列与Aspergillus sydowii、Aspergillus versicolor等曲霉属的菌种核苷酸序列比对结果相似度都很高。
综上，最终确定了这个偷吃了实验室培养基的真菌是一种曲霉菌。
