不同研磨方法对酵母菌DNA得率的影响

不同研磨方法对酵母菌DNA得率的影响

前段时间有实验员说用酵母DNA试剂盒提取的酵母浓度很低，小新之前也提取过酵母DNA，记得浓度还可以，因此有点好奇。经过与实验员沟通后小新怀疑是研磨方法不同导致的差异。小新之前提取酵母DNA用的是液氮研磨，而这次实验员提取时由于液氮刚好用完了，采用的是直接研磨的方法。

酵母菌是一种真菌，具有细胞壁，想要提取酵母DNA首先就要将细胞壁破除。真菌的细胞壁和细菌不同，不能用溶菌酶破开，需要使用破壁酶，而这种酶在市场上比较少见，价格也较为昂贵，因此一般采取机械研磨的方法来破除真菌细胞壁，较为常见的机械研磨方法就是液氮研磨和研磨珠研磨。为了验证研磨方法对DNA提取效率的影响，小新专门进行了以下测试，让我们一起来看看吧。

一、实验目的

测试不同研磨方法对酵母菌DNA得率的影响。

二、实验材料

1．新鲜培养的酵母菌、研钵、液氮、1.5 ml离心管若干。

2．酵母DNA试剂盒（Simgen Cat.No.3401050）、RNase A（50 mg/ml）（Simgen Cat.No.8001001）、样本裂解管L（Simgen Cat. No.: C-001-1）、样本裂解管M（Simgen Cat. No.: C-001-2）和样本裂解管S（Simgen Cat. No.: C-001-3）

3．台式离心机（eppendorf centrifuge 5415 D）、水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）、旋涡振荡器（越新仪器，XH-C）、超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim-100）、电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）

三、实验方法

1．收集过夜培养的酵母菌10 ml菌液，弃尽上清。

2．样本的不同研磨方法：

直接研磨：

(1) 加入100 μl 70℃预热的Buffer AT，勿弃吸头，直接用吸头吹打菌体沉淀，并将其吸出转入研钵中，直接研磨约15分钟左右充分破坏细胞壁。

(2) 向研钵中加入500 μl Buffer AT和2 μl RNase A，继续研磨数次，用吸头将裂解物转入1.5 ml离心管，70℃水浴5分钟。

(3) 加入20 μl蛋白酶K贮存液，旋涡振荡30秒混匀，70℃水浴20分钟。水浴期间每隔2~3分钟翻转离心管数次以帮助DNA的释放。

液氮研磨：

(1) 加入100 μl 70℃预热的Buffer AT，勿弃吸头，直接用吸头吹打菌体沉淀，并将其吸出转入研钵中。倒入液氮浸没菌液（菌液碰到液氮后会立即凝集成块），用力研磨直至菌块呈粉末状。

(2) 当研成粉末状的酵母开始融化时，向研钵中加入500 μl Buffer AT和2 μl RNase A，继续研磨数次，用吸头将裂解物转入1.5 ml离心管，70℃水浴5分钟。

(3) 加入20 μl蛋白酶K贮存液，旋涡振荡30秒混匀，70℃水浴20分钟。水浴期间每隔2~3分钟翻转离心管数次以帮助DNA的释放。

样品裂解管研磨：

（1）加入600 μl 70℃预热的Buffer AT和2 μl RNase A，用吸头吹打菌体沉淀，并将其吸出转移到样品裂解管中，旋涡振荡15分钟左右充分裂解酵母菌。70℃水浴5分钟。

（2）加入20 μl蛋白酶K贮存液，旋涡振荡30秒混匀，70℃水浴20分钟。水浴期间每隔2~3分钟翻转离心管数次以帮助DNA的释放。

（3）12000 rpm离心30秒，小心吸取上清至新的1.5 ml离心管中。

3．加入350 μl Buffer K，盖上管盖，用力摇晃15秒，旋涡振荡30秒混匀。13000 rpm离心5分钟。

4．将步骤3中的离心上清液倒入核酸纯化柱（核酸纯化柱置于2 ml离心管中）中，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

5．弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500 μl Buffer WA，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

6．弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600 μl Buffer WB，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

7．弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，盖上管盖，13200 rpm离心2分钟。

8．弃2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在纯化柱中加入100 μl 70℃预热的Buffer TE，盖上管盖，室温静置2分钟，12000 rpm离心1分钟得到酵母DNA。

四、实验结果

1. 在超微量分光光度计上用Buffer TE调零，测量洗脱下来的DNA，结果如下：

表一 三种研磨方法数据对比

表二 不同型号的样品裂解管研磨酵母菌的数据对比

2. 在1%的琼脂糖凝胶上加入5 μl洗脱的酵母DNA进行电泳，结果如下：

                     图一

M：1 kb plus DNA Ladder

1、2：直接研磨提取的酵母DNA

3、4：液氮研磨提取的酵母DNA

5、6：样品裂解管M研磨提取的酵母DNA

图二

M：1 kb plus DNA Ladder

1、2：样品裂解管S研磨提取的酵母DNA

3、4：样品裂解管M研磨提取的酵母DNA

5、6：样品裂解管L研磨提取的酵母DNA

五、分析与讨论

1. 由表一和图一可知，三种研磨酵母菌的方法中，手动研磨方法效果最差，提取到的酵母DNA平均仅有1.6 μg，液氮研磨方法提取到的酵母DNA平均能达到5.1 μg，样品裂解管的研磨效果最好，提取到的酵母DNA平均高达11.9 μg，是液氮研磨方法的2倍多，是手动研磨方法的7倍多。用玻璃珠震荡法破碎酵母在很多文献中都有记录，在我们的实验中也得到了很好的验证。

2. 由表二和图二可知，样品裂解管M研磨酵母的效果是三种样品裂解管中最好的。Simgen样品裂解管目前有三种型号，L对应的是土壤样本，M对应的是真菌样本，S对应的是细菌样本，而酵母属于真菌，对应的是样品裂解管M，这与实验结果相一致。

3. 传统液氮研磨方法在动植物样本的研磨上效果明显，但是在面对细菌、真菌样本时效果就不明显了，原因就是细菌、真菌类样本是单个细胞分开的，研磨时看不出研磨效果，无法判断是否研磨充分。而样品裂解管可以根据样本的大小选择对应大小的研磨珠，达到最好的研磨效果，比液氮研磨效果更好，且不用费力研磨，只需拿着样品裂解管旋涡振荡就行，如果有条件，甚至可以购买相应的震荡仪，直接解放双手。