质粒DNA的提取是分子生物实验技术中的必备实验技能，市场中有许多质粒DNA提取的试剂盒，但是你是否想过自己动手制作一个质粒DNA试剂盒呢？这次就由小编来教大家怎样利用实验室常用资源来制作一个高纯高效的柱纯化质粒DNA试剂盒。
第一，所在实验室必须拥有这些常用试剂：葡萄糖、Tris、HCl、EDTA、NaOH、SDS、乙酸钾、冰乙酸、无水乙醇、异丙醇和超纯水；
第二，利用这些试剂配制质粒DNA提取所需的溶液：
碱裂解溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0）;
碱裂解溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1%（m/v） SDS;
碱裂解溶液Ⅲ（100ml）：5M 乙酸钾 60ml，冰乙酸 11.5ml，纯水28.5ml;
70%乙醇（50ml）：35ml无水乙醇加15ml超纯水
第三，我们可以去淘宝上购买质粒DNA纯化柱（simgen，7002050）、RNase A（simgen，8001-001）。
所需的试剂都准备齐了，接下来，小编教大家怎样利用这些资源来提取质粒DNA：
1. 收集细菌，用1.5ml离心管收集1-5ml过夜培养的细菌；
2. 向离心管中加入250μl碱裂解溶液Ⅰ悬浮细菌（漩涡振荡或移液器吹打）；
3. 接着向溶液中加入250μl碱裂解溶液Ⅱ裂解细菌（温和上下颠倒离心管数次）；
4. 接着再向溶液中加入250μl碱裂解溶液Ⅲ中和溶液（温和上下翻转离心管数次）；
5. 13000rpm高速离心10min，取上清至另一洁净的离心管中；
6. 向溶液中加入275μl的异丙醇，混匀（温和上下颠倒离心管数次或移液器吹打数次）；
7. 将溶液全部转至纯化柱中（由于体积过大，溶液分两次过柱）；
8. 12000rpm高速离心30s，弃滤液；
9. 向纯化柱中加入70%的乙醇；
10. 12000rpm高速离心30s，弃滤液；
11. 13000rpm高速离心2min，将纯化柱置于洁净的离心管；
12. 向纯化柱中加入60μl超纯水（双蒸水），静止2min;
13. 12000rpm高速离心30s，洗脱即可得到高纯质粒DNA。
注意事项：
1. 此实验自制质粒DNA试剂盒所用的纯化柱和RNase A均是使用simgen的产品，倘若使用其他公司或其他序号的产品，可能会导致实验数据变化；
2. 在实验前将RNase A加到碱裂解溶液Ⅰ中，浓度是100μg/ml;
3. 加入碱裂解溶液Ⅱ后应马上翻转且这步不能超过5min;
4. 异丙醇的体积不要太大，否则会有大量RNA残留。
为了检测自制的质粒DNA试剂盒的性能，小编用1个快速质粒DNA试剂盒产品（simgen）来做对照，所得的质粒DNA的详细OD值见下表：
编号 | Abs260 | Abs280 | Abs230 | 260/230 | 260/280 | 浓度（ng/μl） |
1 | 6.536 | 3.576 | 3.045 | 2.15 | 1.83 | 326.81 |
2 | 6.134 | 3.358 | 2.893 | 2.12 | 1.83 | 306.70 |
3 | 6.024 | 3.278 | 2.656 | 2.27 | 1.84 | 301.20 |
4 | 6.675 | 3.607 | 3.016 | 2.21 | 1.85 | 333.73 |
1、2为对照试剂盒提取得到的质粒DNA，3、4为自制试剂盒提取得到的质粒DNA。
电泳结果图：
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从OD值和电泳图可以看出，自制的质粒DNA试剂盒所提取的DNA在浓度上和RNA残留量都和对照的质粒DNA试剂盒相似，并无明显的差异，而且自制的试剂盒所提取的DNA的盐分残留更少。
好了，今天的新景生物实验室：分子生物百科就到这里了。大家觉得感兴趣的话，可以自己动手试试哦，我们下期再见！！
2016年3月23日
新景生物实验室
