唾液样本不加保存液能在室温存放多久

作者:新景实验室
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前段时间有客户询问唾液采集后在不加保存液的情况下唾液中的DNA可以在室温放多久而不降解为了解答客户的疑问,于是小新测试了唾液在室温放置不同时间段提取DNA效果情况,以及唾液与唾液保存液混合后在不同时间段提取DNA的效果。

一、实验目的

测试唾液样本在室温放置不同时间对唾液DNA的影响及唾液保存液对唾液中DNA的保存效果


二、实验材料

1. 新鲜采集的人唾液、1. 5 ml离心管若干、2 ml离心管若干

2. 唾液DNA纯化试剂盒(Simgen Cat.No.3501050)、唾液DNA保存液(Simgen Cat.No.3522050

3. 台式离心机(eppendorf centrifuge 5415D)、旋涡振荡器(越新仪器,XH-C)、超微量分光光度计(Simgen Cat.No.sim-100)、电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型)

 

三、 实验方法

整个实验温度波动范围22~28

1. 用洁净的一次性水杯收集唾液:

1a. 转移400 μl唾液到一个洁净的1.5 ml离心管中(分别在室温放置0小时、0.5小时、1小时、1.5小时、4小时、7小时以及24小时),加入400 μl Buffer L5,剧烈摇晃离心管35次,再旋涡振荡30秒混匀。最高速(≥12000 rpm)离心1分钟。

1b. 转移400 μl唾液到一个洁净的2 ml离心管中,再加入400 μl唾液DNA保存液混合均匀(分别在室温放置4小时、7小时以及24小时),加入800 μl Buffer L5,剧烈摇晃离心管35次,再旋涡振荡30秒混匀。最高速(≥12000 rpm)离心1分钟。

2. 将步骤1中的离心上清液倒入核酸纯化柱中(核酸纯化柱置于2 ml离心管中)(步骤1b中的上清液分两次滤过核酸纯化柱),盖上管盖,12000 rpm离心30秒。

3. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,在核酸纯化柱中加入700 μl Buffer WA,盖上管盖,12000 rpm离心30秒。

4. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,在核酸纯化柱中加入800 μl Buffer WB,盖上管盖,12000 rpm离心30秒。

5. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,13200 rpm离心2分钟。

6. 2 ml离心管,将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中,在纯化柱的膜中央加入80 μl Buffer TE,盖上管盖,室温静置2分钟,12000 rpm离心30秒得到唾液DNA

 

四、 实验结果

1. 在超微量分光光度计上用Buffer TE调零,测量洗脱下来的DNA,结果如下:

表一


表二

* 标识成蓝色字体的是唾液样本与唾液DNA保存液混合后在室温放置不同的时间提取DNA获得的数据。

 

2. 1%的琼脂糖凝胶上加入5 μl洗脱的唾液DNA进行电泳,结果如下:

图一


12:新鲜采集的唾液立刻提取的DNA

34:采集的唾液室温放置0.5小时提取的DNA

56:采集的唾液室温放置1小时提取的DNA

78:采集的唾液室温放置1.5小时提取的DNA

 

         图二


910采集的唾液室温放置4小时提取的DNA

1112采集的唾液混合保存液室温放置4小时提取的DNA

1314:采集的唾液室温放置7小时提取的DNA

1516:采集的唾液混合保存液室温放置7小时提取的DNA

1718:采集的唾液室温放置24小时提取的DNA

1920:采集的唾液混合保存液室温放置24小时提取的DNA

  图三

Marker1 kb DNA Ladder

左图:唾液采集后与唾液DNA保存液混合后当天提取的唾液DNA

右图:唾液采集后与唾液DNA保存液混合室温放置一年后提取的唾液DNA

                 

五、 分析与讨论

1. 综合表一和表二的数据我们发现,如果直接取唾液样本提取DNA,随着唾液在室温放置时间的延长,DNA的提取浓度出现了先增高(0~1小时)后降低(1~24小时)的现象。结合图一和图二的电泳图我们可以发现,唾液中提取到的DNA均有明显的凋亡细胞DNA的特征,即DNA拖尾的带型与DNA Ladder相似。这就说明了唾液中DNA的主要来源是脱落的口腔上皮细胞,这些细胞大多数已经死亡,细胞核中的染色体结构正处于分崩离析的过程中。

2. 结合不同时间段提取的DNA电泳带型分析,我们发现唾液样本直接提取的DNA中大片段DNA(主带)随着时间的延长越来越暗,小片段DNA则亮度先增加(见泳道13,14,室温存放7小时达到最亮)后减少。这说明有一些尚未明确的原因,比如口腔上皮细胞的自溶过程,或者是唾液中细菌滋生的一些因素导致唾液收集后其中的大片段DNA一直在持续地断裂分解成小片段DNA,这些小片段DNA24小时后大部分都已经吸附不到DNA纯化柱上了(见泳道1718)。这个分解过程在1小时内对提高DNA的提取效率可能是有正向作用的(参考文章提取DNA应该粗暴还是温柔?),但是超过1.5小时后就能明显地发现DNA提取量在迅速地减少。

3. 从表二的数据我们发现唾液与唾液保存液混合后4小时、7小时、24小时后提取到的DNA浓度变化不大,与不加保存液的唾液DNA的提取结果形成了鲜明对比,验证了唾液DNA保存液对唾液DNA的保存效果

4. 最后我们可以明确地回答用户的提问了:唾液样本收集后,DNA马上就开始降解了(或者更精确的描述应该是上皮细胞死亡后DNA就开始分解了),所以如果没有唾液DNA保存液,收集的唾液样本必须在1小时内放入﹣20℃冰箱或更低温度冷冻储藏。室温存放的唾液DNA降解速度大致情况是4小时后分解掉50%数量的DNA24小时后分解掉90%数量的DNA

5. 如果收集的唾液和唾液DNA保存液混合后再存放室温,提取到的DNA则非常稳定,电泳显示的带型(见图二)也没有明显的变化。实际上,我们曾实测过唾液与唾液DNA保存液混合后室温放置一年后提取唾液DNA的效果,从电泳上看,一年后提取的DNA带型与当天提取的DNA带型差别也不是很明显(见图三)即唾液样本经唾液DNA保存液处理后能在常温放置12个月以上DNA没有明显的降解