实测simgen粪便DNA保存液的保存时效

粪便DNA保存液作为Simgen的热销产品深受用户喜爱，咨询的客户也很多，之前就有客户问到产品介绍中描述的“粪便样本中的DNA经粪便保存液稳定后可在室温（15-25℃）保存6个月以上而免于降解”有没有具体的数据资料。当时分光光度计的检测数据有记录，但是电泳图并没有保存，而且当时取样量不多，只做了26周测试，后面就因为样本不够而无法继续进行下去了。为了提供完整可信的实验数据以及探究粪便DNA能不能保存更久的时间，小新采集了样本进行了粪便DNA保存液保存效果的长期测试。

 

实验目的：

测试粪便DNA在Simgen粪便DNA保存液中长时间保存的效果。

 

实验材料：

新鲜采集的人粪便、粪便DNA保存液（Simgen Cat.No.4103050）、粪便DNA纯化试剂盒（配套粪便DNA保存液）（Simgen Cat.No.4111050）

超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋涡振荡器（越新仪器，XH-C）

电热恒温培养箱（上虞市沪越仪器设备厂，DHG 303-0）

电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）

台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）

电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型 ）

 

实验方法：

小新于2022年9月19日采集了5 g粪便样本，加入了10 ml粪便DNA保存液，旋涡振荡直至粪便颗粒全部分散溶解后，置于37℃恒温箱保存至今（除了过年和十一长假，其他时间恒温箱一直开启），期间每隔一段时间提取一次DNA。

 

DNA提取操作步骤如下：

1. 将吸头尖端剪掉，从粪便DNA保存液保存的粪便样本中吸取100 μl悬浊液，转移到自备的1.5 ml离心管中。

2. 加入350 μl 70℃温育的Buffer HST，盖上管盖，混合均匀，70℃水浴5分钟。

3. 12000 rpm离心1分钟。

4. 吸取20 μl蛋白酶K贮存液，加入到一个1.5 ml离心管管底。

5. 吸取200 μl步骤3中的离心上清加入到该1.5 ml离心管中。

6. 加入200 μl Buffer SL，旋涡振荡约15秒混匀。将离心管置于70℃水浴10分钟。

7. 加入200 μl无水乙醇，温和地翻转4~6次混和均匀。低速离心数秒使管盖上的溶液沉降到管底。

8. 吸取步骤7中的混合液加入到核酸纯化柱中（核酸纯化柱置于2 ml离心管中），盖上管盖，离心弃滤液。

9. 依次用500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WB洗涤纯化柱。

10. 高速空离去除残留液体。

11. 弃2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入150 μl 70℃温育的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，离心得到DNA。

 

实验结果：

1、在超微量分光光度计上用试剂盒内的Buffer TE调零，测量洗脱下来的DNA，结果如下：

2、在1%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl洗脱的DNA进行电泳，结果如下：

分析与讨论：

1. 粪便样本经粪便DNA保存液处理后，置于37℃保存至今已达16个月，从分光光度计测量结果来看，每次均成功提取到了DNA，不过浓度略有跳动，总体趋势上看似乎放得越久浓度越高。

2. 经过电泳检测分析，当天提取的粪便DNA浓度偏高，应该是由于样本刚采集，提取到的粪便DNA中混有一些降解的RNA提高了OD₂₆₀的吸收值，这与OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值接近2.0也有对应关系。

3. DNA提取的浓度随粪便样本室温放置的时间延长浓度有升高现象，这是出乎意料的结论。经过认真分析我们认为是以下三个原因所导致：

1） 粪便DNA保存液保存粪便DNA的过程中在缓慢地溶解细菌，随着时间的延长，释放到保存液中的DNA就越多，在后续提取DNA的离心步骤（步骤3）中被沉淀丢失的DNA就会越少，显示出DNA的回收量就越高。

2） 在37℃存放的条件下，释放到粪便DNA保存液中的DNA还是会缓慢地分解的：这个从电泳分析图中就可以观察到，存放1~4个月的样本中提取的DNA拖尾做少，在存放5~16个月的样本中提取的DNA中，比较明显的拖尾就观察到了。DNA的片段越小，相对而言OD260的吸收值就越高，造成了提取的DNA浓度偏高的假象。

3） 最后我们发现，随着37℃放置时间的延长，水分会有部分被蒸发，这就相当于粪便DNA保存液被浓缩了，这很可能是16个月存放的样本提取到的DNA浓度有明显提高的主要原因。

4. 好消息就是：经Simgen粪便DNA保存液保存的粪便，在为期16个月的测试中，粪便DNA虽然产生了一些拖尾，但是基因组DNA的主条带依旧清晰可见，无需担心后续的分子生物学实验应用。

综上所述，我们可以得出结论，粪便样本中的DNA经Simgen粪便DNA保存液稳定后至少可在37℃保存16个月而免于降解。如果将该样本存放到2~8℃，毫无疑问疑问保存时间可以延长到2~3年。至于加了Simgen粪便DNA保存液的粪便样本在常温是否还能保存更久，小新会将测试继续下去，敬请期待。