添加Carrier RNA提高新型冠状病毒核酸检测灵敏度

随着2019年底在武汉出现的由新型冠状病毒引起肺炎的疫情发展至全国，新型冠状病毒核酸检测诊断试剂盒需求量也激增。病毒核酸检测由两块内容组成：核酸提取+PCR检测，对于病毒RNA检测来说，病毒RNA提取反而是核酸检测的重头戏。因为病毒RNA的数量很低（pg级别）且容易降解，提取过程费时费力，以至于提取的病毒RNA的效率直接就决定了检测的灵敏度。本文以实验数据对比方式说明如何提高病毒核酸检测灵敏度。

 下面是中国疾控中心公布的检测新冠病毒的引物、探针序列：

推荐选用针对新型冠状病毒的开放读码框1ab（open reading frame,ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针。

Target 1（ORF1ab）:

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向

试剂在提取10³ copies/ml血清样本的时候，起线艰难，我们很担心提取10² copies/ml血清样本的时候还能不能起线，所以我建议那些宣传自己产品检测灵敏度高达10² copies/ml的厂家，是不是要限制一下配套的病毒核酸提取方法，否则有虚假宣传的嫌疑。

3. RNAisol试剂加了Carrier RNA后，起线简直有了质的飞越，怎么解释？其实也简单：pg级的病毒RNA沉淀效率太低了，但是在纯化体系中加了μg级的Carrier RNA后，沉淀病毒RNA效率完全就不是一个级别的了，我们一起看下照片：

大家都知道，RNA比DNA要脆弱得多，很容易降解，当然100℃不失活的强悍RNA酶是罪魁祸首，Carrier RNA的存在，对于掩护病毒RNA不被RNA酶攻击，也是有重大意义的。RNAisol试剂提取的病毒RNA扩增曲线趴倒，不排除病毒RNA被降解，导致扩增困难的可能性。

4．虽然RNAisol试剂加了Carrier RNA后起线好了很多，但是和病毒核酸纯化试剂盒（含 Carrier RNA）比较，还是大了两个CT值，也就是说病毒核酸纯化试剂盒提取病毒RNA的效率是RNAisol试剂+Carrier RNA的4倍，怎么解释呢？这要从RNAisol试剂提取RNA的原理说起：RNAisol是硫氰酸胍+苯酚+乙酸的混合物，硫氰酸胍负责变性溶解蛋白（对于病毒颗粒最有价值的是溶解蛋白外壳）；苯酚负责萃取变性的蛋白质；乙酸负责维持低pH值，确保DNA维持不溶解的状态。首先在溶解病毒颗粒的环节，以胍盐溶解蛋白（病毒颗粒）的效率低于蛋白酶K消化蛋白（病毒颗粒），使得病毒RNA的释放效率低了一级，其次又在苯酚萃取的环节，由于刻意的调低pH（目的是去掉DNA，个人认为调高pH有助于病毒RNA的回收效率，毕竟宿主的DNA并不干扰病毒RNA的扩增），导致一部分病毒RNA又随着相间沉淀丢失了。两个不利因素的累积，是RNAisol试剂提取病毒RNA效率低的主要原因。

    其实RNAisol试剂用作病毒RNA的提取，并非是最好的选择，但优点是几乎所有的分子生物学实验室都能拿到。RNAisol试剂用作新冠病毒RNA提取检测时，灵敏度要达到10² copies/ml应该是有困难的，如果用RNAisol试剂检测某些样本的结果和本次实验相似（趴到的线），建议在RNAisol试剂中补加Carrier RNA 以提高RNA提取效率，或者购买病毒核酸纯化试剂盒重测，以免漏检或者误判阳性样本。（当然选病毒核酸纯化试剂盒的时候也同样关注是否有Carrier RNA，Carrier RNA 是高灵敏度试剂盒必备)。

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【以上文中实验所用Simgen Carrier RNA（Cat. No. 4003101）供货于华大智造，是华大基因（华大智造）新冠病毒核酸检测试剂盒配套试剂，同时也是生工sangon等厂家的 Carrier RNA 供应商】

【关于Carrier RNA的其他文章】:

Carrier RNA的存在对血浆游离核酸纯化效率的影响

参考文献

[1] nmdc.cn. (2019). 国家病原微生物资源库 新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列 信息来源：中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所. [online] Available at: http://nmdc.cn/#/nCoV